John Cameron Mitchell urodził się w miasteczku El Paso, w stanie Teksas. Na deskach teatru zadebiutował w wieku jedenastu lat, kiedy wystawiano jasełka w jednej ze szkockich benedyktyńskich szkół. Mitchell grał wtedy Maryję. W roku 1985 twórca ujawnił swoją orientację seksualną przed rodziną i przyjaciółmi. Jest zdeklarowanym homoseksualistą oraz członkiem sieci Radical Faerie. Jest również jednym z członków Drama Department Theater Company.
Jego pierwszą profesjonalną rolą, była rola Hucka Finna w musicalu "Big River" wystawianym w Chicago's Goodman Theatre. Nierzadko występował na Broadwayu. Pojawiał się często gościnnie w produkcjach telewizyjnych, takich jak "
MacGyver", "
Strefa mroku" czy "
Dreamer of Oz". Jego pierwsza rola filmowa była naprawdę niewielka. W produkcji "
One More Saturday Night" wcielił się w pijanego nastolatka. Wkrótce dostawał kolejne role i pojawiał się w filmach takich jak "
Niewłaściwe miejsce", "
Księga miłości" albo "
Banda jednej ręki".
W 2001 roku dał się poznać jako twórca filmowy nakręcając produkcję opartą na swojej sztuce "
Cal do szczęścia". W tym filmie zagrał po raz ostatni poświęcając się reżyserii. W przeciągu kilku lat powstały kolejne obrazy: "
Shortbus" oraz "
Między światami".